摘要

采用分子生物学方法、电化学检测方法与表面形貌观察等手段研究了环境友好型的D-tyrosine在抑制和分散腐蚀性铁细菌生物膜菌落中的杀菌增强效果和作用机理。结果表明：D-tyrosine能分解试样表面上的生物膜，使其由附着态转变为浮游态，进入水体，被水中的杀菌剂快速杀灭，进而抑制微生物腐蚀的发生；D-tyrosine+杀菌剂的杀菌效果十分显著，杀菌率可达98.73%，明显优于单加杀菌剂的杀菌效果，且杀菌剂的使用量下降50%~70%。表面分析结果表明，溶液中加入杀菌剂和D-tyrosine后，可使附着在试样表面上的IOB膜快速分解脱落，有效地减缓了腐蚀的发生；腐蚀产物均以Fe的氧化物为主。阻抗谱分析表明，添加D-tyrosine+杀菌剂组合后试样的极化电阻增大，腐蚀速率降低。分析表明，D-tyrosine对杀菌剂的增强效果十分明显，对微生物腐蚀起到很好的抑制减缓作用，有效地缓解了过量杀菌剂引起的微生物抗药性及环境污染问题。

关键词： 微生物腐蚀 ; D-tyrosine ; 铁细菌 ; 杀菌剂 ; 杀菌增强效果

油气资源的开采伴随着大量油田注入水的使用，目前国内油田主要以油田污水作为主要注入水，但由于油田污水中含有大量的浮油、有机质等，为细菌提供了良好的生存环境，在回注井下时发生微生物腐蚀[1,2]。其中好氧铁细菌 (IOB) 是广泛存在的微生物，这类细菌有促进铁离子氧化的作用，而这种作用主要体现在两个方面：一是加快各种元素在细胞内的富集，生成活性较强的化合物；二是其自身可以产生并释放一种可以催化铁氧化反应的酶，从而促进了铁氧化的过程[3,4,5]。因此，铁细菌可以在很大程度上加快铁氧化的反应，可使铁氧化的速率提升数倍，铁离子被铁细菌氧化，生成沉淀后从铁细菌体中排出，并且这些沉淀会聚集粘在菌体周围的菌丝上，形成棕色的黏泥堵塞管道[6,7,8]。

医学研究中发现，D-氨基酸 (DAA) 能调节细菌表面电荷和自溶素活性，抑制细菌芽胞萌发，同时对生物膜的解聚和细菌生态也具有调控作用，因此有学者对油田菌种添加D-氨基酸进行了研究[9,10]。有学者[11]发现一些D-氨基酸在高浓度时可以抑制细菌的生长，这可能是由于D-氨基酸改变了细胞壁肽聚糖的合成而引起的。研究发现[12,13]D-tyrosine可以驱散和分解用于过滤活性污泥的尼龙微滤膜上的生物膜，通过抑制自体诱导物-2 (一种普遍存在的种间群体感应化学物质) 和降低细菌胞外聚合物的产生，并使已形成的生物膜结构解体，进而降低生物膜的吸附性。

目前油田常用的防治微生物腐蚀的方法有物理方法、微生物竞争抑制方法以及化学杀灭方法。其中物理方法在实验室条件下有很好的杀菌效果，在油田实际应用中，操作难度很大；采用微生物间的竞争作用可以控制细菌数量，抑制其活性，此种方法虽然在国内外某些油田得到应用，但技术水平还不成熟[14,15]。目前我国油田主要采用的是利用添加化学试剂来达到杀菌目的，但由于细菌代谢繁殖迅速会逐渐产生耐药性，使我们不得不加大杀菌剂用量，造成恶性循环，给环境和经济造成很大的负担。因此本实验采用油田常用杀菌剂+绿色环保的D-tyrosine相配合，在保证良好杀菌效果的前提下探究能否采用少量杀菌剂+D-tyrosine的配比形成新型复合杀菌剂，进而有效减轻环境危害和经济负担。

1 实验方法

选用Q235碳钢，加工成40 mm×14 mm×2 mm的片状试样，逐级打磨至1000#，蒸馏水冲洗，丙酮除油，无水酒精脱脂，烘干后放入干燥皿干燥48 h；所用IOB菌种是通过富集培养和纯化培养方式从青海某油田注入水中分离出来。本实验选用了两种油田常用杀菌剂，戊二醛和四羟甲基硫酸磷 (THPS)。

培养基配比为：MgSO4·7H2O 1.0 g；(NH4)2SO4 1.0 g；K2HPO4 1.0 g；CaCl2·2H2O 0.4 g；Na2NO3 1.0 g；柠檬酸铁铵10.0 g；加蒸馏水至1000 mL，用10%的氢氧化钠溶液调节pH值在6.8左右，120 ℃高温蒸汽灭菌15 min。分装到150 mL的密封瓶子里 (倒入溶液100 mL)，取1 mL培养箱里富集培养了3 d的细菌接种到溶液瓶子中，按配比依次注入不同浓度的杀菌剂与D-酪氨酸，最后将试样挂入瓶子中，在培养箱中进行失重实验。

IOB富集培养的操作方法：在无菌条件下向100 mL已灭菌基础培养液中，接种1 mL的菌液，放入恒温培养箱，设置温度为37 ℃，培养时间2~3 d，培养基出现浑浊，采用上述相同的方法重复富集培养目标菌，使其成为优势菌株。富集后的培养液中目标菌株得到迅速增殖，占据数量优势，但可能还混杂一定数量的其它微生物，需要对富集培养的微生物进行纯化。分离纯化的操作方法：在1000 mL基础培养液中加入20 g琼脂，高温灭菌并制备无菌平板，采用平板划线法对上述富集菌株划线分离，放入恒温培养箱，设置温度为37 ℃，培养时间2~3 d，从中选取菌落圆润、表面平整、边缘没有参差不齐、个体较大的菌落，重复上述步骤进行多次平板划线分离纯化，获得生长良好的纯种菌落。

采用绝迹稀释法将待测定的菌液用无菌注射器逐级注入到测试瓶中进行接种稀释至10-6，置于 (29±1) ℃恒温培养箱中培养21 d。根据细菌瓶阳性反应和稀释的倍数，计算出菌液中IOB的数量。

浸泡腐蚀后的试样放入质量分数为4%的戊二醛溶液中浸泡15 min，然后用体积分数分别为25%、50%、75%、100%的乙醇逐级脱水，干燥后用于SEM形貌观察，进行相关区域的能谱 (EDS) 分析，并用电子分析天平称量失重前后试样的重量变化，计算腐蚀速率。

采用JSM-6390A扫描电镜 (SEM) 对在腐蚀溶液中浸泡了7 d后的Q235B碳钢试样进行宏观、微观腐蚀形貌和细菌形态观察，采用配套EDS分析对试样上的腐蚀产物进行物相分析

实验采用M2273电化学工作站进行电化学测试。采用环氧树脂密封，工作面逐级打磨至1000#，蒸馏水清洗，丙酮脱油、乙醇脱水后试样浸于溶液中作为工作电极，饱和甘汞电极 (SCE) 作为参比电极，铂片作为辅助电极，电化学阻抗谱测试频率为105~10-2 Hz，施加的正弦波幅值为10 mV，采用 Zsimpwin阻抗软件对测试结果进行拟合和数据处理。

2 结果与讨论

2.1 失重实验分析

表1为Q235B碳钢在不同浓度THPS或戊二醛与D-tyrosine配比下含青海油田IOB培养基中腐蚀7 d后的失重结果。可以看到，在不加入任何杀菌剂的1号溶液中试样平均腐蚀速率最为严重；2、3和4号溶液分别添加了40 mg/L的THPS、戊二醛及D-tyrosine，腐蚀速率及杀菌率都有明显的改善，并且单一的THPS杀菌效果要好于戊二醛，其中4号液只加入了D-tyrosine，杀菌率为0，说明只加入D-tyrosine时，对溶液中细菌的杀菌效果并不明显，甚至不具备杀菌效果，但试样缓蚀效果良好，这是由于D-tyrosine能从钢基体表面剥离IOB生物膜，减缓了IOB生物膜对钢基体的腐蚀作用；而同时加入杀菌剂及D-tyrosine的5号溶液 (40 mg/L THPS+1 mg/L D-tyrosine)、6号溶液 (40 mg/L戊二醛+1 mg/L D-tyrosine) 的杀菌率分别为98.73%和88.33%，缓蚀率分别为31.008%和28.295%，两者的腐蚀速率、杀菌率及缓释率均优于其他的浓度配比。根据标准NACE RP-0775-91，1号溶液属严重腐蚀，其余编号溶液均为中度腐蚀。

表1   Q235B碳钢在含青海油田IOB培养基中腐蚀7 d后的失重结果

2.2 形貌及产物分析

图1为Q235B碳钢在含青海油田IOB培养基中腐蚀7 d后的宏观形貌，可以看到，在不加入杀菌剂与D-tyrosine的1号溶液中的试样表面基本被黄褐色产物层覆盖，腐蚀产物层并不致密，在层下基体上存在大量的坑状腐蚀形貌；单独加入THPS的2号溶液和戊二醛的3号溶液中，试样表面基本呈亮白色金属光泽，基体表面有薄膜状产物贴合覆盖，基体轻微腐蚀；单独加入D-tyrosine的4号溶液中的试样呈亮白色金属光泽，虽然无法直接杀死细菌，但D-tyrosine分解生物膜作用非常明显；而加入THPS+D-tyrosine的5号溶液和戊二醛+D-tyrosine的6号溶液中的试样金属光泽更为明显，在基体上基本不存在腐蚀产物，这主要是由于杀菌剂与D-tyrosine的作用，使得腐蚀产物呈疏水性粘稠状，在重力作用下脱落沉积在溶液底部，同时细菌也随着腐蚀产物脱落到溶液中被大量杀死，使得溶液中有许多红色的游离态絮状物出现，试样基体上细菌无法聚集附着从而达到缓蚀的效果。

图1   Q235B碳钢在含青海油田IOB培养基中腐蚀7 d后的宏观形貌

图2是Q235B碳钢在6种溶液中腐蚀7 d后的SEM像及EDS结果。图2a为试样在IOB培养基中不加杀菌剂与D-tyrosine腐蚀7 d后的SEM图，可以看到试样表面局部覆盖着厚且龟裂的产物层，有部分产物被基体新形成的腐蚀产物顶起脱落，产物层裂隙取向无序但纹路清晰，细菌及其代谢产物呈团簇状堆积，底部存在纵横的裂隙，在贴合基体的部分有乳白色簇状菌落聚集，高倍镜下可观察到在产物层附着的细菌，EDS表明腐蚀产物以Fe的氧化物为主。

图2   Q235B碳钢在6种溶液中腐蚀7 d后的的SEM像及EDS谱

图2b~d为试样在IOB培养基中只加杀菌剂或D-tyrosine腐蚀7 d后的SEM像及EDS结果，在加入40 mg/L THPS的2号液试样表面基本平整 (图2b)，存在少量的腐蚀坑，机械加工痕迹可见，高倍下观察试样表面附有一层膜状结构，薄膜上IOB呈团絮状富集，相比1号溶液不加杀菌剂与D-tyrosine中的试样，菌落减少，腐蚀情况有良好的改观；在加入40 mg/L戊二醛的3号液中的试样表面膜层较厚，部分区域的产物膜呈龟裂状，较多的菌落及其代谢产物粘接在膜层上 (图2c)；在加入40 mg/L D-tyrosine的4号液中试样存在完整的膜层，少有菌落，D-tyrosine分解菌落使其无法在试样表面附着，虽然膜层存在一定的裂隙，但试样整体情况良好，这与失重分析的结果相互对应 (图2d)；EDS分析显示，在添加了杀菌剂或D-tyrosine后，腐蚀产物中Fe的氧化物相比1号液有明显的降低。

图2e是加入了D-tyrosine和THPS后的腐蚀形貌图，可以看出，在加入40 mg/L THPS+1 mg/L D-tyrosine的共同作用下，5号溶液中的试样表面存在较为致密的产物膜，产物膜浅层有部分开裂，在高倍显微镜下能观察到有较多零星的乳白色代谢产物存在，在开裂的缝隙间存在呈团状的胶结产物，非常致密，可进一步阻碍氧进入基体，生物的趋向性使得IOB向含氧量高的地方运动，进一步减少对试样的腐蚀，所以试样的腐蚀情况良好，IOB在基体上几乎不可见，这主要是由于IOB生物膜已随外层产物脱落，数量大量减少，延缓腐蚀的发生，这与腐蚀宏观图和失重结果分析一致。同样也与失重分析中其缓蚀率较高于其他浓度配比下的缓蚀率的结果相一致。EDS成分分析显示，腐蚀产物主要为Fe的氧化物。

图2f是加入D-tyrosine+戊二醛后试样腐蚀形貌图，可以看出，试样产物膜较厚而致密，附着有细菌的疏松产物已经脱落到溶液中，在显微低倍数下观察，膜层表面光滑，试样的机械加工痕迹明显，细菌只有通过膜层的裂隙才能到达基体；在高倍镜下观察，基本没发现有细菌存在，说明加入40 mg/L戊二醛+1 mg/L D-tyrosine后，细菌数量大量减少，很好地起到缓蚀作用，D-tyrosine具有明显抑制与分解生物膜的作用，继而戊二醛通过杀菌作用，消灭细菌。EDS成分分析显示，腐蚀产物主要为Fe的氧化物。

2.3 电化学测量

选取3种典型性的配比进行电化学阻抗的测量，图3为Q235B碳钢分别在不加入杀菌剂、加入40 mg/L THPS和40 mg/L THPS+1 mg/L D-tyrosine 3种不同浓度配比的IOB培养基中腐蚀0、3、7 d后的电化学阻抗图谱。实验结果采用图4所示的不同的等效电路进行拟合，采用Zsimpwin软件进行数据拟合得到的各等效电路参数如表2所示。其中，Rs为模拟溶液电阻，Qdl代表双电层电容的常相位元件，Rt为电荷转移电阻，Qf为腐蚀产物膜或生物膜电容，Rf为腐蚀产物膜或生物膜电阻，W为阻抗[16,17]。根据阻抗谱拟合的数据，1号溶液中的试样在腐蚀7 d后，Rs基本稳定，容抗弧半径逐渐减小，溶液电阻减小，腐蚀速度加快，这与失重试验的结果基本吻合；加入40 mg/L THPS和40 mg/L THPS+1 mg/L D-tyrosine后所测得的阻抗半径随着时间的延长先增大后减小，Rs明显增大，腐蚀速率先减小后逐渐增大。当腐蚀相同时间时，分别加入40 mg/L THPS和40 mg/L THPS+1 mg/L D-tyrosine后测得的阻抗半径大于不加杀菌剂下测得的阻抗半径，且后者效果明显优于其他两种情况下测得的阻抗半径。说明在加入40 mg/L THPS+1 mg/L D-tyrosine后，随着时间的推移，杀菌效果非常显著，具有明显的抑制生物膜形成及促进生物膜解体的活性。

图3   Q235B碳钢在含IOB培养基中分别腐蚀0、3和7 d后的电化学阻抗谱

图4   Q235B碳钢在含IOB培养基中腐蚀0、3和7 d后的等效电路图

表2   Q235B碳钢在含SRB培养基中腐蚀0、3和7 d后EIS拟合结果

3 结论

(1) Q235B碳钢在含IOB的培养基中腐蚀7 d后，添加40 mg/L THPS+1 mg/L D-tyrosine的溶液具有最大的杀菌效果，杀菌率可达98.73%，比单一添加40 mg/L THPS具有更好的杀菌效果和缓蚀作用，40 mg/L THPS+1 mg/L D-tyrosine配比具有最大的缓蚀率可达31.008%，单一添加D-氨基酸虽然不具备杀菌作用，但能从试样基体上分解剥离IOB生物膜，使得腐蚀减缓；IOB腐蚀生成物以铁的氧化物为主。

(2) 表面分析显示，在添加D-tyrosine后，试样表面产物大量脱落，能有效减缓微生物腐蚀的发生，电化学阻抗谱也证明了添加不同配比的杀菌剂+D-tyrosine后腐蚀电阻增加。

(3) 杀菌剂+D-tyrosine能够更加有效地缓解Q235B碳钢的腐蚀，有必要系统地对D氨基酸+杀菌剂配比进行现场中试研究，以期替代目前单纯使用杀菌剂的方法，可显著减缓因杀菌剂用量增多产生的抗药性以及所导致的环境污染问题。

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